Долгосрочное токсикологическое исследование гербицида «Раундап» (Roundup) и генетически модифицированной кукурузы, устойчивой к применению «Раундап». Франция 2012 год

Краткий обзор

Жиль-Эрик Сералини , Эмиль Клэр , Робин Меснаг , Стив Гресс , Николя Дефраже , Мануела Малатеста , Дидье Хеннекин , Жоэль Спиро де Вендомуа

Университет г.Кан, Институт Биологии, Комитет исследований и независимой информации по генной инженерии CRIIGEN and Risk Pole, MRSH-CNRS, EA 2608, Esplanade de la Paix, Caen Cedex 14032, Франция

Университет г.Верона, Факультет неврологии, нейрофизиологии, морфологии и  моторики, г.Верона 37134, Италия

Университет г.Кан, UR ABTE, EA 4651, Bd Maréchal Juin, Caen Cedex 14032, Франция

В статье приведен обзор результатов 2-летнего исследования токсического воздействия генетически модифицированной кукурузы, устойчивой к применению гербицида «Раундап», на состояние здоровья крыс, в рамках которого животных кормили ГМ-кукурузой (в различных дозах от 11% общего состава пищевого рациона), выращенной с применением/без применения гербицид «Раундап», а также давали сам гербицидный препарат (в дозах от 0,1 мкг в воде). У самок показатель уровня смертности в исследуемых группах в 2-3 раза превышал таковой в контрольных группах. Также, смерть животных в исследуемых группах наступала раньше, чем в контрольных группах. Различия применения ГМО в трех группах самцов имели четко выраженный характер. Все результаты исследования находились в прямой зависимости от состава и количества гормонов и пола животных, патологические профили были сопоставимы.  Частота и скорость развития крупных опухолей молочных желез почти во всех случаях были выше в исследуемых группах самок в сравнении с контрольными группами; гипофиз был на втором месте по степени подверженности разрушающему воздействию исследуемых продуктов; действием ГМО и гербицида «Раундап» было обусловлено нарушение баланса половых гормонов в организме. Случаи застоя и некроза печени наблюдались в 2,5-5,5 раз чаще в исследуемых группах самцов по сравнению с контрольными группами. Данная картина патологий подтверждалась результатами оптической микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии. Общий показатель степени выраженности признаков тяжелой нефропатии в 1,3-2,3 раза превышал таковые у крыс в контрольных группах. Размер прощупываемых опухолей, образование которых происходило на 600 дней раньше у самцов исследуемых групп, в 4 раза превышал размер опухолей у самцов контрольных групп.   Результаты биохимических исследований служили подтверждением признаков развития хронической почечной недостаточности; у животных всех исследуемых групп, независимо от полового признака, 76% измененных параметров функции внутренних органов имели отношение к почкам. Полученные результаты можно объяснить нелинейным разрушительным действием гербицида «Раундап» на внутрисекреторные процессы, а также сверхэкспрессией трансгена в ГМО и ее влиянием на метаболические процессы.

© 2012 Elsevier Ltd. Все права защищены.

Сведения о статье

Ключевые слова:ГМО, Раундап, NK603, Крыса, Гербициды на основе Глифосата, Нарушение внутрисекреторных процессов

При использовании сведений, содержащихся в настоящей статье, в печати, пожалуйста, используйте следующую ссылку: Séralini, G.-E., et al. Long term toxicity of a Roundup herbicide and a Roundup-tolerant genetically modified maize. Food Chem. Toxicol. (2012), http://dx.doi.org/10.1016/j.fct.2012.08.005

С тех пор был проведен ряд долгосрочных исследований по откорму нескольких поколений животных. Результаты ряда данных исследований свидетельствовали с некоторой степенью вероятности о безопасности применения исследуемых продуктов, результаты других указывали на необходимость в проведении дальнейших исследований ввиду наличия фактов изменения метаболических процессов (Снелл с соавт., 2011). Однако ни одно из данных исследований не включало в себя тщательное наблюдение за состоянием здоровья животных в течение 2 лет с отбором до 11 проб крови и мочи, и не было нацелено на изучение токсичности кукурузы сорта NK603, устойчивой к применению Р.

Более того, оценка токсичности гербицидов, в общем, сводится к долгосрочному исследованию участия только активного компонента данных продуктов в физиологических процессах в организме млекопитающих, нежели к комплексному исследованию всего препарата в том составе и состоянии, в котором он используется в сельском хозяйстве, как в случае с глифосатом (Вилльямс с соавт., 2000), активным гербицидным компонентом «Раундап». Следует иметь ввиду то, что глифосат способен эффективно проникать в целевые организмы растений, благодаря активирующим добавкам, входящим в состав различных марок гербицида «Раундап», представленных на рынке (Кокс, 2004). Источником обнаруживаемых в водопроводной воде, пище или корме остатков гербицидных веществ является комплексный готовый гербицидный препарат «Раундап», широко применяемый в сельском хозяйстве; не случайно рядом исследователей подчеркивается необходимость изучения потенциального токсического воздействия именно общего состава гербицидных препаратов, нежели отдельных его компонентов (Кокс и Сурган, 2006; Меснаге с соавт., 2010; Моноссон, 2005). Кроме глифосата и прочих активных компонентов в грунтовой воде можно также  обнаружить активирующие добавки (Крог с соавт., 2002), что позволяет сделать вывод о том, что показатели содержания всех компонентов состава в разбавленном виде с большей степенью достоверности отражают профиль загрязнения окружающей среды, чем показатели содержания одного глифосата, в рамках изучения воздействия продукта на состояние здоровья.

С целью восполнения данной нехватки информации нами было проведено комплексное 2-летнее исследование по откорму крыс исследуемыми продуктами биотехнологии. При исследовании токсичности продуктов, содержащих ГМО, некоторые производители придерживаются действующего руководства 408 Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР), несмотря на то, что данное руководство не распространяется на указанные исследования. В своем долгосрочном исследовании мы в большем количестве и с большей частотой использовали параметры анализа, чем таковое предусмотрено указанным стандартом (Таблица 1). Это позволило отследить факторы потенциального отрицательного воздействия на состояние здоровья и возможные причины из возникновения, обусловленные прямыми и косвенными последствиями генетических модификаций в самих ГМО или составом гербицида, применяемого при выращивании генетически модифицированных продуктов (с учетом не только глифосата, но всех компонентов препарата в комплексе), или и тем и другим. С учетом последних ис

2.3. Животные и кормление

Для исследования использовались белые девственные крысы линии Спраг Доули в возрасте 5 недель, предоставленные организацией Harlan (Гана, Франция). Всех животных содержали в клетках из поликарбоната (820 см², производства Genestil, Франция) – по две особи одного пола в каждой клетке. Смена подстилки (Toplit classic, Safe, France) производилась два раза в неделю. Крыс содержали при постоянной температуре 22 ± 3 °C в условиях регулируемой влажности (45-65%) с поддержанием достаточной степени чистоты воздуха и обеспечением 12-часового цикла чередования света и темноты. Крысам был предоставлен свободный доступ к корму и питьевой воде. На протяжении проведения исследования производилась регулярная смена расположения каждой клетки в экспериментальном помещении. Данное долгосрочное 2-летнее экспериментальное исследование проводилось в условиях GPL в соответствии с рекомендациями ОЭСР. По истечении 20-дневного периода приспособления к окружающим условиям 100 самцов и 100 самок крыс были в произвольном порядке распределены по весу в 10 эквивалентных групп, соответственно. Крысам одной группы из указанных групп животных одного пола – контрольной группы – был предоставлен свободный доступ к чистой воде без добавок и корму, включавшему в себя в соответствии со стандартным пищевым рационом аналогичную изогенную культуру кукурузы, использовавшуюся в качестве контрольного образца без предварительной генетической модификации; для шести групп животных был установлен пищевой рацион, включавший в себя ГМ-кукурузу NK603 с различным пропорциональным содержанием в соответствующем рационе: 11, 22 и 33% — обработанную гербицидом «Раундап» или использовавшуюся для эксперимента без предварительной гербицидной обработки. Пищевой рацион для оставшихся трех групп включал в себя контрольный кормовой материал и воду с добавками «Раундап» в различных концентрациях: 1.1 x 10~8% R (0.1 чнм R или 50 нг/л глифосата – концентрация, отражающая стандартный уровень загрязнения водопроводной воды), 0.09% R (400 мг/кг – максимальный остаточный уровень глифосата в некоторых разновидностях генетически модифицированных пищевых продуктов в соответствии с нормативами, принятыми в  США) и 0.5% R (2.25 г/л – концентрация, составляющая половину нормативно установленного уровня разбавления рабочего раствора препарата при использовании в сельскохозяйственных целях), соответственно. Смена контейнеров с пищей и питьем производилась еженедельно. Частота мониторинга – дважды в неделю – позволила обеспечить надлежащий контроль состояния животных путем наблюдения и пальпации, регистрацию клинических симптомов, своевременную оценку любых образовывавшихся опухолей, контроль потребления пищи и воды, а также индивидуального веса тела.

2.4. Биохимические анализы

Отбор образцов крови у каждой крысы производился из хвостовой вены под наркозом с использованием фторированного простого эфира кратковременного действия до начала экспериментального кормления и через 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 и 24 месяца: за 2-летний период исследования каждое выжившее животное прошло серию из 11 анализов. На первом этапе исследования было продемонстрировано отсутствие какого-либо негативного воздействия анестезии на здоровье животных. Были подготовлены две аликвотные доли плазмы и сыворотки с последующим помещением на хранение при -80 ° С. Затем с использованием стандартных методов была произведена оценка взятых образцов по 31 параметру (табл. 1), включая гематологические параметры и показатели свертывания крови, анализ на альбумин, глобулин, общее содержание белка, креатинина, мочевины, кальция, натрия, калия, хлорида, неорганического фосфора, триглицеридов, глюкозы, общего холестерина, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, гамма-глутамил-трансферазы (ГТ), эстрадиола, тестостерона. Кроме того, на 12 и 24 месяцы исследования был произведен анализ содержания С-реактивного белка. Аналогично образцам крови, был произведен отбор 11 образцов мочи после 24-часового пребывания в отдельных метаболических клетках с последующим анализом 16 параметров, включая количественные показатели креатинина, фосфора, калия, хлоридов, натрия, кальция, рН и показатели клиренса. Отбор образцов печени в конце исследования позволил обеспечить анализ активности генов CYP1A1, 1A2, 3A4, 2C9 в клеточных фракциях S9, с глутатион-S-трансферазой и гамма-глутами-трансферазой.

 2.5. Патологоанатомические анализы

Вывод животных из эксперимента в ходе проведения исследования производился в соответствии с правилами этики клинических исследований только по мере необходимости, если таковая была обусловлена очевидным ухудшением состояния здоровья (как, например, 25% потеря  массы тела, рост опухоли до размера, превышавшего25% массы тела, геморрагическое кровотечение, или истощение), и в конце исследования путем обескровливания под действием наркоза на основе фторированного простого эфира. В каждом случае осуществлялся отбор следующих органов: мозга, кишечника, сердца, почек, печени, легких, яичников, селезенки, яичек, надпочечников, придатков яичек, предстательной железы, вилочковой железы, матки, аорты, мочевого пузыря, костей, двенадцатиперстной кишки, пищевода, глаз, подвздошной кишки, тощей кишки, лимфатических узлов, органов лимфоретикулярной системы, молочных желез, поджелудочной железы, паращитовидных желез, пейеровых бляшек, гипофиза, слюнных желез, седалищного нерва, кожи, спинного мозга, желудка, щитовидной железы и трахеи. Первые 14 органов (по меньшей мере, 10 органов каждого животного в зависимости от пола, см.табл. 1) а также любые образовавшиеся опухоли были взвешены. Первые девять органов были разделены на две части с последующим немедленным замораживанием одной из частей в жидком азоте/углекислом льду. Остальные части, включая другие органы, промывали в фосфатно-солевом буфере с помещением на хранение в 4% растворе формалина до патологоанатомического анализа. Данные образцы были в дальнейшем использованы для заливки в парафин, подготовки срезов и гистологического окрашивания с использованием ГЭК. Для просвечивающей электронной микроскопии почки, печень и образцы опухоли были разрезаны на фрагменты площадью 1мм³. Образцы подвергали консервации в предварительно охлажденном 0,1 М фосфатно-солевом буфере с 2% параформальдегида /2.5% глутаральдегида при рН 7,4 и температуре 4°С в течение 3 часов с последующей обработкой, как описано выше (Малатеста с соавт., 2002a).

2.6. Статистический анализ

Обработка биохимических данных производилась путем многофакторного анализа с использованием программного обеспечения SIMCA-P (V12) (Umetrics AB Умео, Швеция). Использовались следующие хемометрические анализы: анализ главных компонент (АГК), анализ методом частных наименьших квадратов к латентным структурам (АМЧНК) и ортогональный АМЧНК (ОАМЧНК), представляющие собой надежные инструменты моделирования, анализа и интерпретации комплексных химических и биологических данных. ОАМЧНК — последняя модификация метода АМЧНК. АМЧНК представляет собой метод регрессии, используемый для целей определения связей между двумя таблицами данных, обозначенными как X и Y. В основе PLS-анализа (Эрикссон с соавт., 2006b) лежат вычисления путем последовательных итераций линейных комбинаций измеряемых X-переменных (предикторов). На основе данных линейных комбинаций X-переменных получают АМЧНК-компоненты (вычислительные векторы t). АМЧНК-компоненты можно рассматривать как новую переменную – латентную переменную – отражающую информацию, содержащуюся в исходных X-переменных, имеющих значение для моделирования и прогнозирования ответа Y-переменной с помощью максимизации квадрата ковариации (Max cov²(X,Y)). Число компонентов определяется перекрестной проверкой. Для построения регрессионной модели программное обеспечение SIMCA использует алгоритм нелинейной итеративной оценки методом частных наименьших квадратов (NIPALS). Для целей исследования использовался дискриминантный анализ ортогональным методом частных наименьших квадратов (ДОАМЧНК) (Велиджие с соавт., 2011;. Виклунд с соавт., 2008.). Цель дискриминантного анализа заключается в определении модели для разделения групп данных наблюдения на основе соответствующих Х-переменных. Матрица X содержит биохимические данные. Матрица Y содержит индикаторные переменные, которые описывают принадлежность данных каждого наблюдения к соответствующим группам. Двоичные переменные используются для кодирования групповой идентичности. Дискриминантный анализ позволяет определить дискриминантный план, в котором прогнозируемые наблюдения надлежащим образом распределены по соответствующим группам. Цель ОАМЧНК-анализа заключается в разделении систематических изменений в блоке X-переменных на две части модели, одна из которых линейно связана с Y (в случае дискриминантного анализа – принадлежность к группам), а другая не имеет никаких связей с Y (ортогональная часть). Компоненты, связанные с Y, называются предикативными, а несвязанные с Y — ортогональными. Данным разбиением блока данных X обеспечивается повышение прозрачности модели и интерпретируемости (Эрикссон и соавт., 2006a). Перед проведением анализа переменные имели средневзвешенные характеристики и были измерены в соответствии с единичной дисперсией.

3. Результаты

3.1. Смертность

Временные показатели выживаемости в контрольной группе, состоявшей из самцов крыс (males), составили в среднем 624 ± 21 дней, в то время как период выживаемости самок (females) в контрольной группе составил 701 ± 20 дней в ходе проведения эксперимента, плюс 5 недель в начале исследования и 3 недели периода приспособления к окружающим условиям. По истечении среднего времени выживания, любой факт смерти был сочтен по большей части обусловленным старением. До истечения данного периода, 30% самцов  контрольной группы (в общей сложности, три крысы) и 20% самок (в общей сложности, две крысы) умерли спонтанно, в то время как смерть 50% самцов и 70% самок в некоторых группах была обусловлена пищевым рационом с содержанием генетически модифицированной кукурузы (рис. 1). Тем не менее, уровень смертности не был пропорционален дозе потребления исследуемых продуктов, что подтверждается достижением порогового показателя смертности в группах потребления ГМ-кукурузы в самой низкой (11%) или средней (22%) концентрации в сбалансированном пищевом рационе, независимо от обработки гербицидом «Раундап» в процессе выращивания. Следует отметить, что смерть первых двух самцов крыс была обусловлена применением эвтаназии по этическим соображениям в связи с образованием на почках опухоли Вильма, размер которой в каждом из двух случаев превышал 25% массы тела. Проведение эвтаназии имело место за год до первого случая смерти в контрольной группе. Первый случай смерти самки был зарегистрирован в группе приема пищи с 22% содержанием ГМ-кукурузы  в результате фиброаденомы молочной железы за 246 дней до первого случая смерти в соответствующей контрольной группе. Максимальная разница между показателями смертности у самцов наблюдалась в течение 17-го месяца в группе потребления пищи с 11% содержанием ГМ-кукурузы, где зарегистрированные случаи смерти в 5 раз превышали показатели смертности в других группах. У самок количество смертей в 6 раз превышало показатели других групп в течение 21 месяца в группе приема пищи с 22% содержанием ГМ-кукурузы, независимо от предварительной обработки гербицидом «Раундап». К концу эксперимента показатели смертности у самок во всех группах приема генетически модифицированной пищи в 2-3 раза превышали показатели смертности в соответствующей контрольной группе, а также случаи смерти регистрировались на более ранних этапах. Самки были более чувствительны к присутствию R в питьевой воде в сравнении с самцами, о чем свидетельствует более короткая продолжительность жизни. Общие причины наступления смерти, описание которых приведено в форме гистограммы (рис. 1), связаны, главным образом, с образованием опухолей молочной железы значительных размеров у самок, и другими органическими осложнениями у самцов.

3.2. Результаты патологоанатомических наблюдений

В процессе проведения эксперимента все крысы проходили тщательный мониторинг на предмет особенностей поведения, внешний вид, наличие нащупываемых опухолей, инфекции. После смерти каждого животного производилось взвешивание не менее 10 органов, а также анализ до 34 органов на макроскопическом и (или) микроскопическом уровнях (табл. 1).

Рис.1

Рис. 1. Показатели смертности крыс, принимавших пищу с содержанием ГМО, предварительно обработанную гербицидом «Раундап», либо использовавшуюся для исследования без гербицидной обработки, а также результаты применения в пищевом рационе крыс непосредственно гербицида «Раундап». Крыс кормили ГМ-кукурузой NK603 (обработанной гербицидом «Раундап» или использовавшейся в эксперименте без предварительной гербицидной обработки) в трех различных дозах (11, 22, 33% в составе пищевого рациона: тонкая, средняя и жирная линии, соответственно) в сравнении с аналогичной изогенной культурой кукурузы (контрольная группа животных, пунктирная линия). «Раундап» добавляли в питьевую воду в 3 возрастающих дозах; обозначение теми же символами (концентрация, отражающая стандартный уровень загрязнения гербицидом окружающей среды (А), максимальный остаточный уровень глифосата в ГМО, используемых в сельском хозяйстве (В), концентрация, составляющая половину нормативно установленного уровня разбавления рабочего раствора препарата при использовании в сельскохозяйственных целях (С), см. раздел 2). Продолжительность жизни во время эксперимента в контрольной группе отражена вертикальной чертой ± SEM (серая зона). В столбчатых гистограммах, приводится наглядное отображение причин смертности (cause of death) на временном участке до серой зоны в сравнении с показателями контрольной группы (0). Поле, закрашенное черным, отображает вынужденное умерщвление животных по этическим соображениям в связи со значительным ухудшением их состояния (образование опухолей, размер которых превышал 25% массы тела, потеря веса более чем на 25%, геморрагические кровотечения и т. д.), а в заштрихованном поле отражено количество случаев спонтанной смертности

Отразить все полученные экспериментальные данные в одном отчете не представляется возможным, следовательно, в настоящей статье представлены наиболее актуальные результаты исследования. Животные не проявляли каких-либо признаков нежелания принимать предлагаемый пищевой рацион, независимо от содержания в нем ГМ-компонента, также не было отмечено каких-либо существенных серьезных различий в массе тела.

Наиболее крупные прощупываемые опухоли (более 17,5 мм в диаметре у самок и 20 мм у самцов) отмечались в 95% всех случаев образования нерегрессивной опухоли, и не имели инфекционный характер. По мере проведения эксперимента рост данных образований постепенно увеличивается в размерах и количестве, однако данный рост не был пропорционален содержанию ГМ-кукурузы в пищевом рационе (рис. 2). Как и в случае с показателями смертности, данный факт свидетельствует о достижении предельного уровня воздействия на состояние здоровья при самых низких дозах. Данные показатели в редких случаях были сопоставимы, однако, отмечались всегда чаще во всех исследуемых группах, чем в контрольной группе, как правило, в 2-3 раза больше у животных обоих полов. Опухоли начали достигать больших размеров в среднем на 94 дня раньше у самок исследуемых групп и в период до 600 дней раньше в 2 мужских группах приема ГМ-кукурузы (с 11 и 22% содержанием, обработанных R, или без предварительной гербицидной обработки)

У самок крыс частота образования наиболее крупных опухолей в общей сложности в 5 раз превышала показатели частоты образования опухолей у самцов по истечении 2 лет, 93% из которых были опухолью молочной железы. Аденомы, фиброаденомы и злокачественные опухоли оказывали отрицательное воздействие на состояние здоровья скорее ввиду очень большого размера, нежели разновидности самой опухоли. Опухоли больших размеров создавали препятствия при дыхании или питании и пищеварении ввиду их расположения в грудной или 

брюшной полости, а также служили причиной кровоизлияния. Также был зарегистрирован один случай метастатической цистаденокарциномы яичников и два случая опухоли кожи. Метастазы были отмечены  только в 2 случаях: один в группе приема пищи с 11% содержанием ГМ-кукурузы, а другой — в группе, получавшей самую высокую дозу гербицида «Раундап».

До 14 месяцев, ни у одного животного в контрольных группах не были отмечены какие-либо признаки образования опухоли, в то время как у 10-30% самок в каждой исследуемой группе развились опухоли, за исключением одной группы (33% ГМО + R). К наступлению 24-го месяца исследования у 50-80% самок животных во всех исследуемых группах развились опухоли (до 3 опухолей на одно животное) в то время как только у 30% крыс в контрольной группе были обнаружены признаки новообразований. Исследование групп приема гербицида «Раундап» показало наибольшую частоту образования опухолей с 80% пораженных животных (до 3 опухолей у одной самки) в каждой группе. Сводная информация по всем опухолям молочных желез по состоянию на конец эксперимента, независимо от их размера, приведена в таблице 2. Та же тенденция наблюдалась в группах, получавших R в питьевой воде; в таблице приведены данные по всем самкам, кроме одной (с метастатическим раком яичников), в дополнение к указанию случаев гипертрофии молочной железы и некоторых случаев гиперплазии с атипией (табл. 2).

Вторым наиболее пораженным органом у самок был гипофиз. Показатели поражения гипофиза в большинстве групп приема ГМ-кукурузы, в целом, примерно в 2 раза превышали таковые в контрольной группе (табл. 2). Опять-таки, в этом отношении отмечалось образование аденом и (или) гипер

плазии и гипертрофии. Во всех группа приема гербицида «Раундап» у 70-80% животных нарушения в данной железе наблюдались в 1.4-2.4 раза чаще, чем у животных в соответствующих контрольных группах.

К концу экспериментального периода частота образования у самцов исследуемых групп больших прощупываемых опухолей (в почках, и в основном в коже) превышала показатели частоты новообразований у самцов контрольной группы в среднем в два раза (в контрольной группе один случай фибромы кожи был отмечен на 23-м месяце). В конце эксперимента, внутренние непрощупываемые опухоли были суммированы, и их сумма была ниже у самцов, чем у самок. Суммарные значения не сильно отличались от таковых в контрольных группах, однако сумма внутренних непрощупываемых опухолей у самок была несколько больше в сравнении с показателями соответствующей контрольной группы (гистограммы рис. 2).

Наиболее сильно пораженными органами у самцов были печень, а также гепато- и пищеварительный тракт и почки (табл. 2 и рис. 3). Показатели частоты возникновения застоев печени, макроскопических и микроскопических очагов некроза у самцов всех исследуемых в 2,5-в 5,5 превышали таковые у самцов контрольных групп. Повышение активности гамма-глутамил-трансферазы печени наблюдалось в частности у самцов групп приема ГМО + R (до 5,4 раз), что, вероятно, было обусловлено заболеванием печени.

Рис.2

Рис.2. Показатели образования наиболее крупных прощупываемых нерегрессивных опухолей (non-regressive palpable tumor) у крыс, принимавших пищу с содержанием ГМО, предварительно обработанную гербицидом «Раундап», либо использовавшуюся для исследования без гербицидной обработки, а также результаты применения в пищевом рационе крыс непосредственно гербицида «Раундап». Обозначения кривых и характеристик пищевого рациона указаны в подписи к рис.1. Наиболее крупные опухоли были прощупываемыми и в диаметре составляли от 20 мм у самцов и 17,5 мм – у самок. Опухоли, превышавшие данный размер, в 95% случаев имели нерегрессивный характер. Сводная информация по всем опухолям приведена в столбчатых гистограммах: черное поле — нерегрессивные наиболее крупные опухоли; белое поле – небольшие внутренние опухоли, серое поле — метастазы.

Таблица 2

Сводная таблица данных по анатомическим патологиям, наблюдавшимся в большинстве случаев.

После показателя количества патологических отклонений в скобках указано количество крыс, у которых данные отклонения имели место. Признаками патологических отклонений у самцов животных были застой печени, макроскопические пятна и микроскопические очаги некроза. Признаки патологических отклонений гепато- и пищеварительного тракта, включают в себя патологию печени, желудка и тонкого кишечника (двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и подвздошной кишки). В таблице перечислены признаки только ярко выраженной или тяжелой хронической прогрессирующей нефропатии (CPN), за исключением двух нефробластом в группах потребления пищи с 11% содержанием ГМО и 22% содержанием ГМО + R. У самок, в основном, отмечались фиброаденомы и аденокарциномы молочной железы; к  признакам патологических отклонений молочных желез были отнесены обнаруженные молочные кисты и гиперплазии с атипией. К патологическим нарушениям гипофиза отнесены аденомы, гипертрофии и гиперплазии. Более подробная информация о признаках патологических отклонений в различных исследуемых группах приведена на рис. 1.

Рис.3

Рис. 3. Результаты наблюдений за анатомическими патологическими проявлениями воздействия на крыс пищи с содержанием ГМ-кукурузы, предварительно обработанной гербицидом «Раундап», либо использовавшейся для исследования без гербицидной обработки, а также результаты применения в пищевом рационе крыс непосредственно гербицида «Раундап». На макроскопических и микроскопических снимках изображены фрагменты печени самцов (A-E) и левой почек (F-I’), молочных желез самок (J-P) и гипофиза (Q-T), в соответствии с таблицей 2. На снимках указан номер каждого животного и обозначение состава пищевого рациона. На макроскопических снимках изображены бледные пятна (D), на микроскопических снимках – очаги некроза в печени (C – изображение неповрежденных клеток, E — базофильный очаг с атипией), и признаки ярко выраженной или тяжелой хронической прогрессирующей нефропатии. Также изображены отмеченные у самок опухоли молочной железы (J, J⁰, N аденокарциномы и K, K⁰, L, L⁰, O, P фиброаденомы) и аденомы гипофиза (R-T) в сравнении с контрольной группой (символ C после номера крысы).

Кроме того, отмечалось общее дозозависимое повышение активности цитохром в присутствии R (в питьевой воде или пищевом рационе с содержанием ГМ-кукурузы) до 5,7 раз при максимальной дозе. Результаты просвечивающей электронной микроскопии образцов печени подтвердили факт изменений, наблюдавшихся у животных всех исследуемых групп, связанных с дисперсией или появлением гликогена в озерцах, увеличением остаточных тел и расширением крист в митохондриях (рис. 4). Результаты анализа органов животных групп кормления ГМ-кукурузой, обработанной гербицидом «Раундап» (на стадии выращивания) или без гербицидной обработки свидетельствуют о более низкой степени транскрипции мРНК и рРНК из-за более высокого содержания гетерохроматина и снижение ядрышковых плотных фибриллярных компонентов. У животных группы ГМО + R (при максимальной дозе) гладкий эндоплазматический ретикулюм был резко увеличен с уменьшением размера ядрышек, за счет чего стал более плотным. В отношении результатов приема непосредственно гербицида «Раундап» наблюдались аналогичные тенденции с частичным возобновлением активности ядрышек при максимальной дозе.

В пораженных почках с раздутыми воспаленными областями отмечалось увеличение количества ярко выраженных признаков тяжелой хронической прогрессивной нефропатии, которое было до 2 раз выше в группе приема  ГМ-кукурузы в концентрации 33% или низких доз R (табл. 2 и рис. 3).

Рис.4

Рис. 4. Ультраструктура гепатоцитов у самцов крыс групп, в которых отмечалась наивысшая степень патологии печени. (1) Типичный гепатоцит крысы из контрольной группы (Bar 2мкм, за исключением 4). (2) Воздействие при самой низкой дозе «Раундап». Гликоген (G) рассеивается в цитоплазме. L — липидные капли, N — ядро; R – шероховатый эндоплазматический ретикулюм. (3) Гепатоциты животных, получавших ГМ-кукурузу (ГМО) в количестве 22% от общего состава пищевого рациона. В цитоплазме образуются крупные озерца гликогена. M – митохондрии. (4) Детальная иллюстрация воздействия пищи с 22% содержанием ГМО (Bar 1 мкм). (а) Скопление остаточных тел (помечено звездочками). (b) В митохондриях видны увеличенные кристи (помечено стрелками)

3.3. Биохимические анализы

Химический анализ не выявил каких-либо существенных различий между составами пищевого рациона и подготовленной кукурузы; поэтому пищевые рационы животных были классифицированы как эквивалентные по существу, за исключением количественного состава трансгенного ДНК. Например, анализ не показал какой-либо разницы между общим содержанием изофлавонов в пищевых рационах. Кроме того, в рамках исследования был произведен количественный анализ других специфических соединений, в отношении которых не во всех случаях устанавливаются требования по обеспечению эквивалентности. Среди фенольных кислот, единственные стабильные и достоверные (р <0,01) результаты был получены по анализу содержания феруловой кислоты, которое было снижено в обеих группах приема пищи с содержанием ГМ-кукурузы и ГМ-кукурузы + R на 16-30% по сравнению с пищевым рационом в контрольной группе (889 ± 107, 735 ± 89 соответственно, и 1057 ± 127 мг/кг в контрольной группе) и кофейной кислоты на 21-53% (17,5 ± 2,1, 10,3 ± 1,3 против 22,1 ± управления 2,6 мг/кг).

Биохимические показатели состояния здоровья крыс были получены путем статистического анализа полученных результатов анализа проб, взятых на 15 месяц исследования, так как в данной временной точке был произведен пробоотбор, когда большинство животных были еще живы (в исследуемых группах: 90% самцов, 94% самок, и 100% животных в контрольных группах). Для каждой исследуемой группы и контрольных групп были построены ДОАМЧНК-модели 2-го класса с разделением по полу. Для выбора дискриминантных переменных были использованы модели с объяснимой дисперсией R²(Y) P 80% и подтверждаемой возможностью прогнозирования Q²(Y) P 60%, (рис. 5а), при значимости их коэффициентов регрессии, подтверждаемой с 99% уровнем достоверности. Таким образом, у самок исследуемых групп нарушения почек обуславливались изменениями на биохимическом уровне (82% от общего количества показателей патологических нарушений). Отмечалось повышение содержания в моче ионов (Na, Cl) или мочевины. Соответственно, пропорциональное снижение содержания ионов наблюдалось в сыворотке крови (рис. 5B), что также касается содержания P, K и Ca. Во всех исследуемых группах отмечалось снижение показателей содержания креатинина или показателей клиренса в моче в сравнении с таковыми у самок контрольной группы (табл. 3). У самцов групп кормления ГМ-кукурузой, обработанной гербицидом (или такой обработки), 87% дискриминантных переменных были связаны с почками, однако, профили патологических нарушений были менее ярко выражены ввиду сложных хронических нефропатий и смертности. Таким образом, у всех животных обоих полов из исследуемых групп 76% дискриминантных переменных по сравнению с контрольной группой были связаны с почками.

Кроме того, у самок (табл. 3) дисбаланс «андроген/эстроген» в сыворотке крови был обусловлен приемом пищи с содержанием ГМ-кукурузы и приемом R (минимальный доверительный уровень — 95%, рис. 5B), а у самцов прием самых высоких доз R послужил причиной повышения содержания эстрогенов в более чем в два раза.

4. Обсуждение результатов

В данном отчете представлены результаты первого экспериментального исследования по откорму грызунов (крыс) ГМ-кукурузой (NK603), устойчивой к применению гербицида «Раундап», на всем протяжении их жизни с непосредственным добавлением коммерческого препарата «Раундап» с целью определения возможного токсического воздействия данных продуктов на состояние здоровья животных.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что, как это часто бывает в случае гормональных заболеваний, большинство наблюдавшихся признаков воздействия в рамках проведения исследования не были пропорциональны дозе потребления исследуемых продуктов (ГМ-кукуруза, обработанная R или использовавшаяся для эксперимента без гербицидной обработки; собственно, гербицидный препарат «Раундап»), не носили монотонный характер проявления и в ряде случаев достигали порогового значения выраженности (Ванденберг с соавт., 2012). Патологические симптомы подобной степени выраженности, наблюдавшиеся на протяжении исследовании, были результатом потребления исследуемых продуктов в концентрациях от самых низких до самых высоких, свидетельствуя о пороге вредного воздействия. Это соответствует уровням накопления веществ, которое может иметь место в результате попадания в организм из пищи или из окружающей среды, например, при потреблении пищи с 11% содержанием ГМ-кукурузы, или 50 нг/л глифосата в коммерческом препарате «Раундап» (такой уровень концентрации может быть обнаружен в некоторых случаях в питьевой водопроводной воде, и, как правило, лежит в установленных пределах).

Продолжительность жизни в контрольной группе животных соответствовала средней продолжительности жизни крыс, однако, как это часто бывает с большинством млекопитающих, включая людей (WHO, 2012), смерть самцов наступала в среднем раньше, чем смерть самок, за исключением некоторых исследуемых групп самок. Вследствие кормления животных обоих полов исследуемыми продуктами наблюдалось увеличение числа крупных опухолей в 2-3-раза по сравнению с показателями образования крупных опухолей у животных контрольных групп, а также числа опухолей молочной железы в сравнении с самками той же линии Спраг Доули (Sprague Dawley (Harlan)) (Брикс с соавт., 2005), и, в целом, 3-кратное увеличение числа опухолей молочной железы по сравнению с результатами крупнейшего исследования с использованием 1329 самок крыс линии Спраг Доули (Чандра с соавт., 1992). В рамках проведения нашего исследования также отмечались более ускоренные темпы роста по сравнению с показателями роста опухолей у животных контрольной группы, несмотря на тот факт, что случаи образования большинства опухолей наблюдались после 18 месяцев с момента начала эксперимента. Образование первых крупных прощупываемых опухолей имело место через 4 и 7 месяцев после начала проведения эксперимента у самцов и самок, соответственно, что свидетельствует о неадекватности стандартных 90-дневных испытаний по откорму для оценки токсического воздействия ГМ сельскохозяйственных культур и продовольствия на состояние здоровья животных (Сералини с соавт., 2011).

Значительное ухудшение состояния здоровья самок, обуславливавшее необходимость в применении эвтаназии, а также приводившее к смертельным исходам, было вызвано в большинстве случаев образованием крупных опухолей молочной железы. Данные случаи образования опухолей, по всей видимости, тесно коррелировали с приемом исследуемых продуктов в разных дозах, что не представляется возможным установить в отношении контрольных групп. Образование таких опухолей, как известно, главным образом обуславливается уровнем эстрогена (Харвелл с соавт., 2000). Мы наблюдали чрезвычайно ярко выраженные признаки индукции опухолей молочной железы при применении исключительно гербицидного препарата «Раундап» даже в очень низких дозах. В ходе проведения ряда экспериментальных исследований было доказано, что «Раундап» оказывает разрушительное действие на ароматазу, участвующую в процессе биосинтеза эстрогенов (Richard соавт., 2005), а также нарушает работу рецепторов эстрогенов и андрогенов в клетках (Гаснье с соавт., 2009). Помимо этого, «Раундап», по-видимому, также выступает деструктором половой эндокринной системы в естественных условиях у самцов (Romano с соавт., 2010). Половые стероидные гормоны также претерпевают изменения у крыс вследствие приема продукта. Факт обусловленности данных явлений уровнем гормонов подтверждается усилением гипофизарной дисфункции у самок после приема исследуемых продуктов. На этом уровне за счет эстрогенной модификации может активироваться механизм обратной связи (Попович с соавт., 2011;. WALF и Frye, 2010). Подобная картина патологических нарушений, обусловленных применением ГМ-кукурузы, содержащей остатки «Раундап» таким образом, может быть объяснена, по крайней мере, наличием самих остатков гербицида, принимая во внимание то, что средние дозы применения «Раундап» соответствуют допустимым остаточным концентрациям данного гербицида в ГМО.

Примечательно то, что в группах животных действие потребляемой ГМ-кукурузы без применения R также выражалось в значительном увеличении опухолей в размерах и высоких показателях смертности. Возможным объяснением полученных данных может служить факт образования специфического(их) соединения(ий) в генетически модифицированном корме, которое либо оказывает непосредственное токсическое воздействие и (или) тормозит протекание некоторых реакций, что в свою очередь обуславливает хроническое токсическое воздействие. Данные наблюдения противоречат тому факту, что разновидность использовавшейся в данном исследовании ГМ-кукурузы по классификации производителей и регулирующих органов отнесена к продукции, по существу эквивалентной изогенной кукурузе нетрансгенного типа. Ввиду невозможности детальной оценки химического состава ГМ-кукурузы, использование существенной эквивалентности не представляется достаточным для выявления потенциальных 

неизвестных токсинов и, следовательно, не может заменить результаты долгосрочного исследования по откорму животных пищей, содержащей ГМО. Причина данного воздействия может быть связана с тем, что ГМ-кукуруза NK603, использованная в данном исследовании, была подвергнута трансгенной обработке для обеспечения сверхэкспрессивности модифицированной 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат-синтазы опухолеобразующей бактерии Agrobacterium tumefaciens (EPSPS) (Хаммонд с соавт., 2004), обуславливающей устойчивость к действию гербицида «Раундап». Искусственно модифицированный фермент EPSPS не подавляется глифосатом в отличие от естественного фермента. Как известно, данный фермент катализирует первый этап биосинтеза ароматической аминокислоты в каскаде реакций шикиматного пути формирования ароматического кольца в растении; дополнительными продуктами данного пути являются эстрогенные изофлавоны и их гликозиды (Дьюк с соавт., 2003). Признаков нарушения таковых в нашем исследовании обнаружено не было. Для сравнения, концентрации кофейной и феруловой кислоты в пищевом рационе с ГМ-компонентом, которые также представляют собой вторичные метаболиты указанного пути биосинтеза, не всегда измеряемые при проведении нормативных испытаний, были значительно снижены, за счет чего мог снизиться защитный эффект данных веществ против канцерогенеза и даже образования опухолей у млекопитающих (Кюнциг с соавт., 1984;.. Баксаран с соавт., 2010). Кроме того, действие данных фенольных кислот и, в частности, феруловой кислоты может заключаться в модулировании рецепторов эстрогена или каскада реакций биосинтеза эстрогена в клетках млекопитающих (Чанг с соавт., 2006). Это не исключает действия других неизвестных метаболитов. Это объяснение также соответствует тому, что наблюдаемые эффекты NK603 и R не являются кумулятивными и достигли пороговых значений выраженности. Данный факт означает, что кукуруза NK603 и R могут вызвать гормональные нарушения в одних и тех же биохимических и физиологических реакциях.

Как и ожидалось, образование опухолей молочных желез у самцов происходит гораздо реже, чем у самок. Наступление смерти среди самцов крыс было в основном обусловлено развитием печеночно-почечных нарушений высокой степени тяжести, что подтверждало первые признаки токсичности, которые наблюдались в рамках проведения 90-дневных  исследований по откорму животных кукурузы NK603 (Спиро де Вендомуа с соавт., 2009). У самок снижение уровня ионов почек наблюдалось на биохимическом уровне на 15-й месяц исследования, при обнаружении признаков тяжелой нефропатии в организме мертвых животных самцов на поздних этапах, на патологоанатомическом уровне. На 3 месяц в группах приема 19 съедобных ГМ-культур, содержавших остатки пестицидов, также наблюдались ранние признаки токсичности в почках и печени (Сералини и соавт., 2011). На самом деле, хронической прогрессирующей нефропатии подвержены только пожилые самцы крыс (Хард и Хан, 2004). Нарушение показателей работы почек, возможно, было вызвано снижением содержания фенольных кислот в нашем исследовании, так как кофейная и феруловая кислоты благотворно влияют на почки, предотвращая окислительный стресс (Сринвасан с соавт., 2005;. У Рехман и Султана, 2011). Таким же образом, нами было ранее показано, что экстракты растений, содержащих феруловую и кофейную кислоты, способствовали детоксикации эмбриональных клеток почки после загрязнения гербицидом «Раундап» (Гаснье с соавт., 2011). Таким образом, можно предположить, что потребление NK603 при снижении концентрации данных соединений может спровоцировать раннее старение почек на физиологическом уровне, что имело место в описываемом исследовании, как R за счет окислительного стресса.

Нарушения, обнаруженные нами в печени самцов, были характерны для хронической интоксикации, что подтверждалось изменениями параметров функционирования почек и печени на биохимическом уровне. Данные наблюдений, свидетельствовавшие о меньшем нарушении функции печени у самок, можно объяснить улучшенной адаптацией физиологических процессов к метаболизму эстрогенов. Кроме того, как было продемонстрировано в ряде исследований (Спиро де Вендомуа с соавт., 2009) уровень экспрессии ферментов печени однозначно обусловлен половой принадлежностью, что также подтверждалось результатами 90-дневного эксперимента по откорму крыс кукурузой NK603. Тем не менее, при проведении долгосрочного исследования по откорму мышей ГМ-соей, устойчивой к применению «Раундап» у животных были обнаружены признаки раннего старения печени (Малатеста с соавт., 2008a). В настоящем исследовании, более глубокий анализ на ультраструктурном уровне показал наличие факторов торможения транскрипции и другие дефекты в структуре ядра клетки, которые были сопоставимы у животных обеих полов, и дозозависимы в отношении воздействия на гепатоциты во всех диетах с исследуемыми продуктами. Полученные данные соответствовали документированным результатам исследований токсического воздействия «Раундап» в очень низкой концентрации в разбавленных растворах на апоптоз, функции митохондрий, клеточных мембран и некроз гепатоцитов и других клеточных линий, что обуславливало деградацию печени (Беначур и Сералини, 2009;. Беначур с соавт.., 2007 , Гаснье с соавт.., 2010;. Пеиксото, 2005).

Нарушения, связанные, по крайней мере, с реакциями биосинтеза эстрогена и (или) усилением окислительного стресса в связи с приемом исследуемых продуктов требуют дальнейшего исследования. Эту проблему можно решить путем применения транскриптомных, протеомических и метаболических методов анализа молекулярных профилей почек и печени, а также ГМ-кукурузы NK603 (Джиао с соавт., 2010;.. Жоу с соавт., 2009; Зола с соавт., 2008). Другие возможные причины наблюдаемых признаков патогенного воздействия могут быть связаны с нарушенной экспрессией гена в результате эффектов трансгенинсерционного, общего мутагенного или метаболического характера (Латам с соавт., 2006;.. Уилсон с соавт., 2006), как это было продемонстрировано при исследовании ГМ-кукурузы MON810 (Росати с соавт., 2008). Также нельзя исключать факт последующего нарушения общего обмена веществ в ГМО, могущего послужить причиной, например, продуцирования других потенциально активных соединений, таких как микроРНК (Жанг с соавт., 2012) или лейкотоксин-диолов (Маркаверич с соавт., 2005).

В заключение, следует отметить, что согласно ранее полученным данным исследований, потребление с водой глифосата в концентрациях, превышающих допустимые пределы, может привести к отказу печени и почек (EPA). Результаты исследования, представленные здесь, ясно указывают на то, что глифосат, содержащийся в комплексных гербицидных препаратах, предназначенных для сельскохозяйственных целей, в концентрациях значительно ниже официально установленных пределов безопасности, способен вызвать тяжелые гормонозависимые нарушения молочной железы, печени и почек. Подобным образом, нарушение пути биосинтеза, которое может быть обусловлено сверхэкспрессией трансгенов EPSPS в ГМ-кукурузе NK603, может привести к подобным патологиям, которые, в свою очередь, могут быть связаны с аномальным составом или с дисбалансом метаболитов фенольных кислот, или связанных с ними соединений. Также нельзя исключать другие мутагенные и метаболические эффекты генетически модифицированной пищи. Данные эффекты станут предметом предстоящих исследований в условиях присутствия в тканях органов крыс трансгенных продуктов и глифосата. Исследования токсичности на репродуктивную функцию у животных нескольких поколений станут также богатым источником новых идей при изучении данных проблем. Данный отчет представляет собой первое подробное документальное отражение долгосрочного исследования неблагоприятного воздействия на состояние здоровья животных, обусловленного потреблением гербицидоустойчивой ГМ-кукурузы и препарата «Раундап» — наиболее широко применяемого во всем мире гербицида.

В целом, сведения о значительных биохимических нарушениях и отклонениях физиологических процессов, приведенные в настоящей статье подтверждают патологическое воздействие описываемых ГМО и гербицида «Раундап» на состояние здоровья животных обоих полов, с разной степенью выраженности. На основании полученных данных мы предлагаем проводить более тщательный анализ сельскохозяйственной продовольственной продукции, содержащей ГМО и пестициды готовых препаратов, путем долгосрочных исследований для обеспечения достоверной оценки потенциального токсического воздействия данных продуктов на состояние здоровья живых организмов.

Рис. 5

Рис. 5. Дискриминантный анализ биохимических данных АМЧНК-методом (данные самок групп приема пищи с 33% содержанием ГМО в сравнении с данными самок контрольной группы). (A) коэффициенты регрессии ДОАМЧНК по предиктивной составляющей, с доверительными интервалами формата «jack-knife» при 99%-ном уровне достоверности, указывают на дискриминантные параметры по сравнению с показателями контрольной группы на месяц 15 исследования (Аббревиатуры: U – мочевой, Uex – выводимый с мочой в течение 24 ч, APPT – Активированное частичное тромбопластиновое время, MCV – Средний объем эритроцита, PT протромбиновое время, RBC – Эритроциты, ALT – Аланинаминотрансфераза, MCHC – Средняя концентрация гемоглобина в эритроците, A/G — Соотношение «альбумин/глобулин», WBC — Лейкоциты, AST – Аспартатаминотрансфераза). (B) В данном случае указаны подробные примеры распределения значимых дискриминантных переменных между показателями параметров биохимических анализов у самок группы приема пищи с 33% содержанием ГМО (жирная линия) и у самок контрольной группы (пунктирная линия). По оси Х: животные; по оси у: показатели биохимических анализов содержания в сыворотке или моче Na, Cl, эстрадиола, тестостерона. Профили свидетельствуют о снижении концентрации ионов почек и дисбалансе половых гормонов в сравнении с соответствующими показателями контрольной группы.

Таблица 3

Относительное изменение в процентах показателей параметров, указывающих на нарушение функции почек у самок

ДОАМЧНК был выполнен на 48 переменных в месяц 15. Здесь мы показали средние различия (%) переменных (дискриминант при 99% доверительном уровне, жирным шрифтом) с указанием почек параметры самок, вместе с половыми гормонами. Мужской патологии почек уже показано в таблице 2.

Столкновение интересов

Настоящим авторы заявляют об отсутствии столкновения каких-либо интересов в связи с настоящим исследованием.

Выражение признательности

Выражаем благодарность Майклу Антониу за конструктивные замечания и оказание содействия в составлении англоязычной версии рукописи, а также Херраде Хеммердингер за корректуру. Мы выражаем глубокую признательность Ассоциации CERES, Фонду “Charles Leopold Mayer pour le Progrès de l’Homme”, Министерству Научных Исследований Франции и CRI-IGEN за неизмеримую помощь и поддержку.

Список литературы

Baskaran,    N.,    Manoharan,    S.,    Balakrishnan,    S.,    Pugalendhi,    P.,    2010.

Chemopreventive potential of ferulic acid in 7,12-dimethylbenz[a]anthracene-induced mammary carcinogenesis in Sprague-Dawley rats. Eur. J. Pharmacol.

637, 22–29. Benachour, N., Seralini, G.E., 2009. Glyphosate formulations induce apoptosis and

necrosis in human umbilical, embryonic, and placental cells. Chem. Res. Toxicol.

22, 97–105. Benachour, N., Sipahutar, H., Moslemi, S., Gasnier, C., Travert, C., Seralini, G.E., 2007.

Time- and dose-dependent effects of Roundup on human embryonic and

placental cells. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 53, 126–133. Brix, A.E., Nyska, A., Haseman, J.K., Sells, D.M., Jokinen, M.P., Walker, N.J., 2005.

Incidences of selected lesions in control female Harlan Sprague-Dawley rats

from two-year studies performed by the National Toxicology Program. Toxicol.

Pathol. 33, 477–483. Chandra, M., Riley, M.G., Johnson, D.E., 1992. Spontaneous neoplasms in aged

Sprague-Dawley rats. Arch. Toxicol. 66, 496–502. Chang, C.J., Chiu, J.H., Tseng, L.M., Chang, C.H., Chien, T.M., Wu, C.W., Lui, W.Y., 2006.

Modulation of HER2 expression by ferulic acid on human breast cancer MCF7

cells. Eur. J. Clin. Invest. 36, 588–596. Cox, C., 2004. Herbicide factsheet – Glyphosate. J. pestic. reform 24, 10–15. Cox, C., Surgan, M., 2006. Unidentified inert ingredients in pesticides: implications

for human and environmental health. Environ. Health Perspect. 114, 1803–

1806. Domingo, J.L., Giné Bordonaba, J., 2011. A literature review on the safety assessment

of genetically modified plants. Environ. Int. 37, 734–742. Duke, S.O., Rimando, A.M., Pace, P.F., Reddy, K.N., Smeda, R.J., 2003. Isoflavone,

glyphosate, and aminomethylphosphonic acid levels in seeds of glyphosate-treated, glyphosate-resistant soybean. J. Agric. Food. Chem. 51, 340–344. EPA, 2012. Basic Information about Glyphosate in Drinking Water. <http://

water.epa.gov/drink/contaminants/basicinformation/glyphosate.cfm>        (Last

access June). Eriksson, L., Johansson, E., Kettaneh-Wold, N., Trygg, J., Wikström, C., Wold, S.,

2006a. Multi- and Megavariate Data Analysis Part II Advanced Applications and

Method Extensions. Umetrics, Umea, Sweden. Eriksson,  L.,  Johansson,  E.,  kettaneh-Wold,  N.,  Wold,  S.,  2006b.  Multi  and

Megavariate Data Analysis Part I – Principles and Applications. Umetrics AB,

Umea, Sweden. Gasnier, C., Benachour, N., Clair, E., Travert, C., Langlois, F., Laurant, C., Decroix-Laporte, C., Séralini, G.-E., 2010. Dig1 protects against cell death provoked by

glyphosate-based herbicides in human liver cell lines. J. Occup. Med. Toxicol. 5,

29. Gasnier, C., Dumont, C., Benachour, N., Clair, E., Chagnon, M.C., Seralini, G.E., 2009.

Glyphosate-based herbicides are toxic and endocrine disruptors in human cell

lines. Toxicology 262, 184–191. Gasnier, C., Laurant, C., Decroix-Laporte, C., Mesnage, R., Clair, E., Travert, C., Séralini,

G.E., 2011. Defined plant extracts can protect human cells against combined

xenobiotic effects. J. Occup. Med. Toxicol. 6, 3. Hammond, B., Dudek, R., Lemen, J., Nemeth, M., 2004. Results of a 13 week safety

assurance study with rats fed grain from glyphosate tolerant corn. Food Chem.

Toxicol. 42, 1003–1014. Hammond, B., Lemen, J., Dudek, R., Ward, D., Jiang, C., Nemeth, M., Burns, J., 2006a.

Results of a 90 day safety assurance study with rats fed grain from corn

rootworm-protected corn. Food Chem. Toxicol. 44, 147–160. Hammond, B.G., Dudek, R., Lemen, J.K., Nemeth, M.A., 2006b. Results of a 90 day

safety assurance study with rats fed grain from corn borer-protected corn. Food

Chem. Toxicol. 44, 1092–1099. Hard, G.C., Khan, K.N., 2004. A contemporary overview of chronic progressive

nephropathy in  the laboratory rat, and its significance for human risk

assessment. Toxicol. Pathol. 32, 171–180. Harvell, D.M., Strecker, T.E., Tochacek, M., Xie, B., Pennington, K.L., McComb, R.D.,

Roy, S.K., Shull, J.D., 2000. Rat strain-specific actions of 17beta-estradiol in the

mammary   gland:   correlation   between   estrogen-induced   lobuloalveolar

hyperplasia and susceptibility to estrogen-induced mammary cancers. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 97, 2779–2784. Jiao, Z., Si, X.X., Li, G.K., Zhang, Z.M., Xu, X.P., 2010. Unintended compositional

changes in transgenic rice seeds (Oryza sativa L.) studied by spectral and

chromatographic analysis coupled with chemometrics methods. J. Agric. Food.

Chem. 58, 1746–1754. Krogh, K.A., Vejrup, K.V., Mogensen, B.B., Halling-Sørensen, B., 2002. Liquid

chromatography-mass spectrometry method to determine alcohol ethoxylates

and alkylamine ethoxylates in soil interstitial water, ground water and surface

water samples. J. Chromatogr. A 957, 45–57. Kuenzig, W., Chau, J., Norkus, E., Holowaschenko, H., Newmark, H., Mergens, W.,

Conney, A.H., 1984. Caffeic and ferulic acid as blockers of nitrosamine

formation. Carcinogenesis 5, 309–313. Latham, J.R., Wilson, A.K., Steinbrecher, R.A., 2006. The mutational consequences of

plant transformation. J. Biomed. Biotechnol. 2006, 25376.

Malatesta, M., Boraldi, F., Annovi, G., Baldelli, B., Battistelli, S., Biggiogera, M.,

Quaglino, D., 2008a. A long-term study on female mice fed on a genetically

modified soybean: effects on liver ageing. Histochem. Cell Biol. 130, 967–977. Malatesta, M., Caporaloni, C., Gavaudan, S., Rocchi, M.B., Serafini, S., Tiberi, C.,

Gazzanelli,        G.,        2002a.        Ultrastructural        morphometrical        and

immunocytochemical  analyses   of   hepatocyte  nuclei   from   mice   fed   on

genetically modified soybean. Cell Struct. Funct. 27, 173–180. Malatesta, M., Caporaloni, C., Rossi, L., Battistelli, S., Rocchi, M.B., Tonucci, F.,

Gazzanelli, G., 2002b. Ultrastructural analysis of pancreatic acinar cells from

mice fed on genetically modified soybean. J. Anat. 201, 409–415. Malatesta, M., Perdoni, F., Santin, G., Battistelli, S., Muller, S., Biggiogera, M., 2008b.

Hepatoma tissue culture (HTC) cells as a model for investigating the effects of

low concentrations of herbicide on cell structure and function. Toxicol. In Vitro

22, 1853–1860. Markaverich, B.M., Crowley, J.R., Alejandro, M.A., Shoulars, K., Casajuna, N., Mani, S.,

Reyna, A., Sharp, J., 2005. Leukotoxin diols from ground corncob bedding disrupt

estrous cyclicity in rats and stimulate MCF-7 breast cancer cell proliferation.

Environ. Health Perspect. 113, 1698–1704. Mesnage, R., Clair, E., Séralini, G.-E., 2010. Roundup in Genetically modified

crops: Regulation and toxicity in mammals. Theorie in der Ökologie 16,

31–33. Monosson, E., 2005. Chemical mixtures: considering the evolution of toxicology and

chemical assessment. Environ. Health Perspect. 113, 383–390. Peixoto,  F.,  2005.  Comparative  effects  of  the  Roundup  and  glyphosate  on

mitochondrial oxidative phosphorylation. Chemosphere 61, 1115–1122. Popovics, P., Rekasi, Z., Stewart, A.J., Kovacs, M., 2011. Regulation of pituitary

inhibin/activin subunits and follistatin gene expression by GnRH in female rats.

J. Endocrinol. 210, 71–79. Richard, S., Moslemi, S., Sipahutar, H., Benachour, N., Seralini, G.E., 2005. Differential

effects of glyphosate and roundup on human placental cells and aromatase.

Environ. Health Perspect. 113, 716–720. Romano, M.A., Romano, R.M., Santos, L.D., Wisniewski, P., Campos, D.A., de Souza,

P.B., Viau, P., Bernardi, M.M., Nunes, M.T., de Oliveira, C.A., 2012. Glyphosate

impairs male offspring reproductive development by disrupting gonadotropin

expression. Arch. Toxicol. 86, 663–673. Romano, R.M., Romano, M.A., Bernardi, M.M., Furtado, P.V., Oliveira, C.A., 2010.

Prepubertal exposure to commercial formulation of the herbicide glyphosate

alters testosterone levels and testicular morphology. Arch. Toxicol. 84, 309–

317. Rosati, A., Bogani, P., Santarlasci, A., Buiatti, M., 2008. Characterisation of 3⁰

transgene insertion site and derived mRNAs in MON810 YieldGard maize. Plant

Mol. Biol. 67, 271–281. Séralini, G.-E., Cellier, D., de Vendomois, J.S., 2007. New analysis of a rat feeding

study with a genetically modified maize reveals signs of hepatorenal toxicity.

Arch. Environ. Contam. Toxicol. 52, 596–602. Séralini, G.-E., Mesnage, R., Clair, E., Gress, S., Spiroux De Vendomois, J., Cellier, D.,

2011. Genetically modified crops safety assessments: present limits and

possible improvements. Environ. Sci. Eur., 23. Séralini, G.E., Spiroux de Vendomois, J., Cellier, D., Sultan, C., Buiatti, M., Gallagher,

L., Antoniou, M., Dronamraju, K.R., 2009. How subchronic and chronic health

effects can be neglected for GMOs, pesticides or chemicals. Int. J. Biol. Sci. 5,

438–443. 

Snell, C., Bernheim, A., Bergé, J.-B., Kuntz, M., Pascal, G., Paris, A., Ricroch, A.E., 2011.

Assessment of the health impact  of GM plant diets in long-term and

multigenerational animal feeding trials: a literature review. Food Chem.

Toxicol. 50, 1134–1148. Spiroux de Vendômois, J., Cellier, D., Velot, C., Clair, E., Mesnage, R., Seralini, G.E.,

2010. Debate on GMOs health risks after statistical findings in regulatory tests.

Int. J. Biol. Sci. 6, 590–598. Spiroux de Vendômois, J., Roullier, F., Cellier, D., Seralini, G.E., 2009. A comparison of

the effects of three GM corn varieties on mammalian health. Int. J. Biol. Sci. 5,

706–726. Srinivasan, M., Rukkumani, R., Ram Sudheer, A., Menon, V.P., 2005. Ferulic acid, a

natural protector against carbon tetrachloride-induced toxicity. Fundam. Clin.

Pharmacol. 19, 491–496. U Rehman, M., Sultana, S., 2011. Attenuation of oxidative stress, inflammation and

early markers of tumor promotion by caffeic acid in Fe-NTA exposed kidneys of

Wistar rats. Mol. Cell. Biochem. 357, 115–124. Vandenberg, L.N., Colborn, T., Hayes, T.B., Heindel, J.J., Jacobs Jr., D.R., Lee, D.H.,

Shioda, T., Soto, A.M., Vom Saal, F.S., Welshons, W.V., Zoeller, R.T., Myers, J.P.,

2012. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and

nonmonotonic dose responses. Endocr. Rev. 33, 378–455. Walf, A.A., Frye, C.A., 2010. Raloxifene and/or estradiol decrease anxiety-like and

depressive-like behavior, whereas only estradiol increases carcinogen-induced

tumorigenesis and uterine proliferation among ovariectomized rats. Behav.

Pharmacol. 21, 231–240. Weljie, A.M., Bondareva, A., Zang, P., Jirik, F.R., 2011. ¹H NMR metabolomics

identification of markers of hypoxia-induced metabolic shifts in a breast cancer

model system. J. Biomol. NMR 49, 185–193. WHO, 2012. World Health Statistics. WHO Press. <http://who.int> (Last access

August). Wiklund, S., Johansson, E., Sjostrom, L., Mellerowicz, E.J., Edlund, U., Shockcor, J.P.,

Gottfries, J., Moritz, T., Trygg, J., 2008. Visualization of GC/TOF-MS-based

metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds

using OPLS class models. Anal. Chem. 80, 115–122. Williams, G.M., Kroes, R., Munro, I.C., 2000. Safety evaluation and risk assessment of

the herbicide Roundup and its active ingredient, glyphosate, for humans. Regul.

Toxicol. Pharmacol. 31, 117–165. Wilson,  A.K.,  Latham,  J.R.,   Steinbrecher,  R.A.,   2006.  Transformation-induced

mutations   in   transgenic   plants:   analysis   and   biosafety   implications.

Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 23, 209–237. Zhang, L., Hou, D., Chen, X., Li, D., Zhu, L., Zhang, Y., Li, J., Bian, Z., Liang, X., Cai, X.,

Yin, Y., Wang, C., Zhang, T., Zhu, D., Zhang, D., Xu, J., Chen, Q., Ba, Y., Liu, J., Wang,

Q., Chen, J., Wang, J., Wang, M., Zhang, Q., Zhang, J., Zen, K., Zhang, C.Y., 2012.

Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1: evidence

of cross-kingdom regulation by microRNA. Cell Res. 22, 107–126. Zhou, J., Ma, C., Xu, H., Yuan, K., Lu, X., Zhu, Z., Wu, Y., Xu, G., 2009. Metabolic

profiling of transgenic rice with cryIAc and sck genes: an evaluation of

unintended  effects  at  metabolic  level  by  using  GC-FID  and  GC-MS.  J.

Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877, 725–732. Zolla, L., Rinalducci, S.,  Antonioli,  P.,  Righetti,  P.G.,  2008.  Proteomics  as  a

complementary tool for identifying unintended side effects occurring in

transgenic maize seeds as a result of genetic modifications. J. Proteome Res.7, 1850–1861.